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              elisa試劑盒的應用及詳解

              發布時間:2022-07-01   點擊次數:307次

               

              ELISA試劑盒在國內有許多種叫法,例如:ELISA檢測試劑盒、ELISA Kit、酶聯免疫試劑盒、酶聯免疫吸附測定試劑盒、酶聯免疫分析試劑盒、酶免試劑盒等,比較常見的叫法是ELISA檢測試劑盒、酶聯免疫吸附測定試劑盒等。

              ELISA試劑盒自從60-70年代問世以來,得到多數科研工作者的認可及推崇,在歐美及中國獲得很大的推廣,尤其是國內生化領域的長足發展。

              Elisa生物試驗是一種敏感性高,特異性強,重復性好的實驗診斷方法。由于其試劑穩定、易保存,操作簡便,結果判斷較客觀等因素,已廣泛應用在免疫學檢驗的各領域中。ELISA檢測試劑盒適用于體外定性檢測人血清或血漿中的抗人類戊型肝炎(HEV)病毒 IgM 抗體ELISA檢測。


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              應用檢測技術:

              免疫測定技術的基礎在于抗原抗體之間的特異結合反應,所以任何優質的診斷試劑離不開優質的原料,如抗原抗體,酶等。以前用于免疫測定的抗原通常為各種純化抗原,而抗體則為純化抗原免疫動物后獲得的多克隆抗體和使用雜交瘤技術得到的單克隆抗體,而抗原或抗體的標記物如酶標結合物則通過各種化學合成方法制備。近年來,隨著分子生物學的發展,使用基因工程方法制備各種特殊的抗原或抗體及其酶結合物等免疫測定試劑幾成為現實的新一代試劑,各種新型使用的測定方法也不斷出現。

              ELISA檢測試劑盒應用定性夾心免疫檢測技術,用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板條,這些多肽是中國型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很強的肽段,分別來自于該毒株的開放閱讀框2和開放閱讀框3。將樣品或標準品加入孔中并孵育,如果其中存在HEV IgM抗體,這些抗體就會與HEV 的多肽抗原結合,并固定在上面,洗板除去其它非特異性抗體和樣品中的其它成份。然后加入羊抗人IgM-HRP(辣根過氧化物酶)酶結合物,經第二次孵育后,酶結合物就會與第一次孵育結合上的HEV IgM抗體相結合,洗板除去未結合的酶結合物,加入TMB底物溶液,在第三次孵育時會發生酶-底物反應,只有那些含有HEV IgM抗體和酶結合物所形成的復合物的孔才會發生顏色變化,加入硫酸溶液終止酶和底物間的反應,并在波長: 450nm處測量O.D.,按照本HEV IgM抗體elisa試劑盒的測試標準, O.D.值大于或等于Cut-Off值的樣品被認為是初試陽性。

              用途

              ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性,酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性,又保留酶的活性。在測定時,受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體,也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后,底物被酶催化成為有色產物,產物的量與標本中受檢物質的量直接相關,故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,間接地放大了免疫反應的結果,使測定方法達到很高的敏感度。 ELISA可用于測定抗原,也可用于測定抗體。

              產品特點

              一、高效、靈敏、特異的抗體;

              二、穩定的重復性和可靠性;

              三、吸附性能好,空白值低,孔底透明度高的固相載體;

              四、適用血清、血漿、組織勻漿液、細胞培養上清液、尿液等等多種標本類型;

              五、節省實驗經費。


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              檢測方法

              一、雙抗體夾心法

              1.包被:用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為110μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml,4 過夜。次日,棄去孔內溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘。(簡稱洗滌,下同)。

              2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37 孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔)。

              3. 加酶標抗體:于各反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0.1ml。37 孵育0.51小時,洗滌。

              4. 加底物液顯色:于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml,37 1030分鐘。

              5. 終止反應:于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。

              6. 結果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結果:反應孔內顏色越深,陽性程度越強,陰性反應為無色或極淺,依據所呈顏色的深淺,以“+"、“-"號表示。也可測OD值:在ELISA檢測儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對照孔調零后測各孔OD值,若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。

              二、間接法

              1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至110μg/ml,每孔加0.1ml,4℃過夜;

              2.次日洗滌3次;

              3.加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應孔中,37℃孵育1小時,洗滌;

              4.(同時做空白、陰性及陽性孔對照)于反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml;

              5.37℃孵育35-60分鐘,洗滌;

              6.’最后一遍用DDW洗滌。

              其余步驟同“雙抗體夾心法"的4、5、6。

              (檢測方法后續)

              臨床測定技術的發展主要在于方法學的發展,而方法學的發展依托于試劑生產技術不斷進步更新和型標記物的應用。分子生物學正在并最終肯定會讓對整個生命科學有一個全面而徹底的認識,其對免疫測定技術發展的影響也是直接而又有效的,對以前一些難以檢測的生物活性物質的測定,并且大大提高了檢測的靈敏度和特異性。

              應用領域

              ELISA法是免疫診斷中的一項新技術,現已成功地應用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定,根據已經使用的結果,認為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩定及易于自動化操作等特點。不僅適用于臨床標本的檢查,而且由于一天之內可以檢查幾百甚至上千份標本,因此,也適合于血清流行病學調查。本法不僅可以用來測定抗體,而且也可用于測定體液中的循環抗原,所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫學各領域的應用范圍日益擴大,

              可概括四個方面:

              1、免疫酶染色各種細胞內成份的定位。

              2、研究抗酶抗體的合成。

              3、顯現微量的免疫沉淀反應。

              4、定量檢測體液中抗原或抗體成份。

               

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